一、抽血做dna是看血的哪项指标
文章来源：国内癌症防治杂志，2022年6月第14卷第3期
随着液态活检的快速发展，采用体液对患者的分子特征进行分析成为可能，特别是基于循环DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的高通量测序（next generation sequencing，NGS）技术，因其无创或微创、检测时间短、能够反映瘤内和转移灶异质性、可动态监测治疗疗效等优势而在临床得到越来越广泛的应用。
与组织样本相比，采用ctDNA进行基因检测在样本收集和处理、检测技术要求、结果解读和临床应用等方面存在诸多不同，且目前国内尚缺少ctDNA基因检测标准，因此限制了其在临床上的规范应用。
为此，国内抗癌协会标志专注委员会组织国内临床、理、检验、生物信息分析和高通量检测领域专家，参考国内外ctDNA临床应用共识、指南和更新文献，结合国内外现有的高通量测序技术要求和临床实践， 从ctDNA的生物学特征、临床应用价值和范围、高通量检测的标准要求及其未来发展趋势等方面提出本共识 ，以促进ctDNA NGS的健康规范发展。
01
ctDNA概述
ctDNA水平一般呈动态变化，且受多种因素影响：
⑴理组织类型、部位、分期、负荷等因素可影响ctDNA的释放。在负荷较轻、特定部位（如颅内）和特定组织学（如胶质瘤），以及增殖、凋亡和/或血管化水平较低的患者中，ctDNA水平通常较低。
⑵大量其他来源的DNA干扰。如其他正常细胞或白细胞来源的DNA，与ctDNA一起被称为游离DNA（cell free DNA，cfDNA）。多种生理和理因素，如怀孕、剧烈运动、外伤、炎症、心肌梗死、自身免疫性疾和急性中风等也会影响cfDNA的释放。
⑶克隆性造血细胞产生的cfDNA携带的基因突变信息可能会干扰ctDNA检测结果。此外，其突变基因还受不同内外因素影响（包括年龄、吸烟、种族和治疗等），如ASXL1突变在吸烟者中富集，DNA损伤应答（DNA-damaged response，DDR）基因（TP53、PPM1D、CHEK2）突变在接受放射、铂类药物和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂治疗的患者中更为常见。
⑸药物治疗影响ctDNA含量。有研究显示，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者接受酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治疗后，ctDNA含量在24 h达到顶峰，随后快速降低，提示药物也会影响ctDNA含量。
与组织学检测相比，ctDNA检测具有无创或微创，可反复取材，收集、处理和分析报告周转时间（turn-around time，TAT）短等优势。同时能克服空间异质性，可相对全面地实时反映患者的分子特征。与单独组织活检相比，血浆ctDNA还可增加驱动基因突变检出率。然而，与组织标本相比，外周血ctDNA含量较低，容易造成临床检测阴性结果。由于胚系变异或克隆性造血突变的存在，若未用白细胞作为对照，也可能导致阳性结果。此外，不同患者或同一患者不同时段释放入血的ctDNA量也存在差异，这也给ctDNA的临床检测和结果解读带来困难。一项对国内66家ctDNA NGS检测实验质控的回顾分析显示，ctDNA检测报告书写质量相对满意的实验仅占42.4%，其中74.2%的报告仅列了相应癌种与目前治疗药物更相关的基因变异结果，对检测方法细节和相应检测局限缺乏详细的描述。
专家共识： ctDNA是由细胞主动分泌或细胞在凋亡或坏死过程中释放入循环系统的DNA片段；其丰度受多种因素影响，波动较大，在内外因素特别是治疗压力下，其携带的生物信息可能会发生演变，且受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变干扰，在临床检测和报告解读过程中应特别注意。
02
ctDNA NGS检测的临床应用
2.1 ctDNA NGS检测在伴随诊断中的价值
伴随诊断（panion diagnostics，CDx）被认为是个性化医疗中不可或缺的工具，其要求测试结果所提供的信息足以保证相应治疗药物的安全性和有效性，预期用途为指导用药，识别能够从特定治疗中受益的患者。
ctDNA检测作为CDx在更早的临床实践应用是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变检测，主要用于识别可能从EGFR TKI获益的晚期NSCLC患者。在ENSURE研究中，ctDNA检测EGFR del和L858R突变的特异性为98.2%，敏感性为76.7%；而根据ctDNA检测结果接受厄洛替尼治疗的患者较化疗患者的PFS明显改善。基于该研究结果，FDA于2016年批准首款液体活检CDx产品Cobas EGFR Mutation Test v2、随后国家药品监督管理局（NMPA）于20年批准该款CDx产品在国内上。在FLAURA研究中，ctDNA T790M 阳性患者对奥希替尼的客观缓解率（objective response rate，ORR）与组织活检阳性患者一致。据此，2020年FDA批准Guardant360 CDx用于血浆ctDNA检测以识别可获益于奥希替尼治疗的EGFR L858R/del/T790M突变，埃万妥单抗（JNJ-6372）对应的EGFR 20ins突变以及索托拉西布对应的KRAS G12C突变的NSCLC患者。随后又批准适用范围更广的一款CDx产品FoundationOne Liquid CDx，主要用于识别包括NSCLC EGFR敏感突变（L858R/del）、ALK重排、MET 14外显子跳跃，前列腺癌BRCA1/2及ATM突变，上皮性卵巢癌/输卵管癌或原发性腹膜癌BRCA1/2突变以及乳腺癌PIK3CA突变，以指导其药物。
基于SOLAR-1研究结果，FDA于20年批准第二款液体活检CDx产品Therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit。该产品主要通过血浆ctDNA检测识别受益于PIK3CA抑制剂阿培利司（与氟维司群联合）治疗的PIK3CA突变晚期HR+/HER2-乳腺癌患者。一项关于乳腺癌的荟萃分析显示，ctDNA检测PIK3CA突变的敏感性和特异性分别为86%和98%。乳腺癌NCCN指南2022 V1版推荐，复发不可切除或转移性HR+/HER2-乳腺癌应进行基于穿刺组织或ctDNA的PIK3CA突变分析，若首选ctDNA检测但结果呈阴性时，应再次进行组织检测确认。
在胃食管腺癌中，原发和转移灶往往存在异质性，ctDNA检测可全面反映全身情况，从而更有效地指导精准治疗。研究显示联合组织和血浆ctDNA HER2扩增检测可提高对食管癌及食管胃交界部癌患者抗HER2治疗的预测价值。胃癌和食管癌及食管胃交界部癌NCCN指南2022 V1建议不适合组织活检的胃癌和食管癌患者可考虑进行血浆ctDNA NGS检测，但同时强调ctDNA检测为阴性时并不排除经组织分析基因变异的存在。此外，由于尚缺乏有效的治疗手段，NCCN 指南2022 V1建议转移性胰腺癌在无法经活检获得足够组织时可考虑进行ctDNA NGS检测，且至少应包括ALK、NRG1、NTRK、ROS1融合基因变异与BRAF、BRCA1/2、HER2、KRAS、PALB2基因突变分析。皮肤恶性黑色瘤NCCN 指南2022 V1也提及ctDNA NGS检测可作为其分子分型的替代性方式。
近期已有研究初步显示，基于ctDNA NGS检测筛选参与临床试验患者具有足够的准确性，且在不影响疗效的情况下可提高试验入组率，缩短筛查时间。这些研究结果提示ctDNA NGS检测在临床试验中具有一定优势和应用前景。然而，除了已获批的伴随诊断产品，大多数ctDNA在其他靶向治疗指导的有效性和实用性证据依然不足，尚需大量实验结果和临床试验支撑，后续研究应尽可能纳入预期适用人群，通过严格设计的临床研究充分验证其临床意义。针对不同癌种，血浆ctDNA基因突变检测与组织基因突变检测的一致性仍存在较大差异，对于检测结果差异较大的癌种，应综合考虑其临床应用风险，慎重考虑ctDNA NGS检测作为组织基因检测替代方式的可行性。
专家共识：目前已有临床证据支持ctDNA NGS检测可应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期实体的伴随诊断，但涉及的驱动基因及其变异类型与相应分析体系均有严格限定，若超适应症应用时，建议与患者就检测必要性、检测费用以及局限性等内容进行充分知情。ctDNA NGS检测已被国内外专家共识或指南建议作为多种晚期恶性组织基因检测的替代方式，但依据其分析结果实时制定临床治疗策略时仍需高级别循证证据支持。
ctDNA NGS检测对治疗疗效评估及预后风险分的价值
采用标志物和影像学等传统方法评估分子靶向和免疫检查点抑制剂治疗疗效时无法动态反映特征性的分子演化，ctDNA NGS检测可对驱动基因相关ctDNA的丰度变化进行监测，判断治疗应答，其中在NSCLC的EGFR靶向治疗中，EGFR敏感突变早期清除可用于预测EGFR TKI疗效。一项动态监测ctDNA预测NSCLC临床治疗疗效的真实世界研究发现，基线ctDNA含量越高或变异数量越多，预示着OS越短（治疗后ctDNA清除的患者PFS和OS更长），而且ctDNA也是与治疗类型和评估时相点设置无关的独立预后因素。接受免疫检查点抑制剂治疗的晚期NSCLC患者，ctDNA响应（降低>50%）与影像学评估的疗效吻合，且与更好的PFS和OS相关，其中治疗后5~9周早期影像评估为灶稳定的患者，ctDNA评估为响应的患者中位OS显著延长（3个月vs .4个月，HR=0.36）。受体型蛋白酪氨酸磷酸酶D（protein tyrosine phosphatase，receptor type D，PTPRD）在多种中表达失活，在非鳞NSCLC 中PTPRD磷酸酶结构域发生缺失性突变时，二线治疗能更多从阿特珠单抗中获益 （中位OS：24.04个月 vs 9.69个月，HR=0.16、P=0.0273），并且PTPRD是独立的预后因素，且不依赖于TMB和PD-L1表达或（和）TP53、EGFR、KRAS基因突变状态。在转移性激素抵抗前列腺癌中，ctDNA水平降低与PSA降低超过30%相关。TOPARP-A研究也发现，接受PARP抑制剂治疗的晚期前列腺癌患者ctDNA降低与OS相关。但在近期一项黑色素瘤合并脑转移免疫检查点抑制剂治疗研究中发现血浆ctDNA分析并不能很好地监测颅内灶疗效，这显示了血脑屏障对ctDNA检测的不利影响。
微小残留灶（minimal residual disease，MRD）概念更早来自血液。实体的MRD概念更多被称为分子残留灶（molecular residual disease，MRD），是指经过治疗后，传统影像学（包括PET/CT）或其他实验方法不能发现，但通过液体活检发现的来源分子异常，代表持续存在和临床进展可能。TracerX研究证实了ctDNA作为MRD检测的可行性并评估了MRD检测对NSCLC术后复发的预测价值。一项回顾性研究纳入了22例接受新辅助治疗（大多为新辅助免疫治疗）的ⅠB~ⅢA期NSCLC患者，其ctDNA动态分析结果与术后理学评价高度一致，敏感性为100.00%、准确性为91.67%，其中术后3~8 d ctDNA检测阳性的患者具有更高的复发风险（HR=5.37），且基于ctDNA NGS检测预测分子复发事件较影像学标准评估的中位时间提前了6.83个月。2年非小细胞肺癌分子残留灶专家共识将肺癌分子异常定义为在外周血可稳定检测出丰度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驱动基因或其他Ⅰ/Ⅱ类基因变异。一项通过检测ctDNA监测MRD的临床研究纳入261例可手术根治切除的NSCLC患者，结果显示，术前ctDNA检测发现36.4%的患者为阳性，表明可能存在未发生ctDNA脱落的（non-shedding tumor），但不影响术后MRD监测。该研究还发现术后单个节点MRD检测阴性患者的预后显著优于阳性患者（HR=0.08，95%CI：0.02~0.33），说明动态监测可进一步提升预测准确性，这一结果首次定义了潜在治愈人群，且发现术后MRD阴性人群不能从辅助治疗获益；仅脑部复发的患者MRD 检出比例显著降低（20%，1/5）。在结肠癌患者中，术后ctDNA连续监测较影像学标准评估更多可提前16.5个月预测分子复发事件。多项研究表明，结直肠癌术后及辅助治疗后ctDNA阳性与疾复发之间呈强相关性，术后的ctDNA分析结果可作为预后预测依据。近期，首项基于ctDNA的结肠癌术后辅助治疗随机对照试验DYNAMIC结果显示，ctDNA指导下的辅助化疗策略可以在不影响患者总体无复发生存期的前提下，降低接近50%（从28%降低至%）的术后辅助化疗率，避免了部分患者的无效化疗。该研究为Ⅱ期结肠癌患者的术后辅助治疗决策提供了直接依据。IMvigor010是一项高危肌浸润性尿上皮癌辅助免疫治疗的Ⅲ期临床研究，研究结果显示ctDNA阳性患者接受阿替利珠单抗的中位无生存期和OS显著改善，复发风险降低42%，死亡风险降低41%。目前，众多公司推出实体瘤MRD检测产品，但并无获批（FDA/NMPA）产品上，亟待通过大样本、多中心、前瞻性临床试验验证这些产品的临床效用。
专家共识： 晚期实体分子靶向或免疫检查点抑制剂治疗开始后，基于NGS检测的ctDNA水平定量和动态变化分析，有望成为新兴的疗效评估途径。ctDNA MRD检测是全新的个性化技术应用领域，尚难以建立通用性技术标准，亟待通过大样本、多中心、前瞻性的临床试验验证其临床效用。ctDNA NGS检测在临床上用于靶向或免疫治疗评估和分时，建议就检测价值、局限性和费用等进行充分知情。
2.3 ctDNA NGS检测用于获得性耐药机制分析的价值
获得性耐药是影响精准治疗疗效的重要因素，也是抗药物临床应用全程管理面临的更大挑战。ctDNA NGS检测由于自身优势现已广泛应用于获得性耐药分子机制分析及后续的用药指导。如接受奥希替尼治疗的晚期NSCLC患者发生耐药时，EGFR基因常检出新的突变，其中EGFR G796/C797突变占24.7%，EGFR L792突变占10.8%，EGFR L7/G7突变占9.7%。基于ctDNA NGS检测发现ALK 抑制剂耐药机制具有高度异质性，如克唑替尼耐药时常发生ALK L16M、I11T、D1203N、G1269A/F14L等继发突变，可能存在旁激活相关的NRAS G12V、EGFR R108K、PIK3CA E545K等突变；塞瑞替尼耐药时常发生ALK G1128A、G1202R、G1269A、I11T/E1210K等继发突变，可能存在旁激活相关KIT D820E、MET E1012、EGFR P265_C291del等突变；阿来替尼耐药时常发生ALK G1202R、W1295C、G1202R/L16M等继发突变，可能存在旁激活相关 EGFR P753S突变；洛拉替尼耐药时常发生ALK G1202R/G1269A 继发突变，可能存在旁激活BRAF V600E、MET D1246N等突变。在接受抗EGFR单抗治疗的转移性结直肠癌患者中，RAS信通中蛋白编码基因的突变和/或EGFR胞外结构域（extra-cellular domain，ECD）改变可能是导致耐药的主要分子机制。在胃癌治疗中，ctDNA监测发现HER2拷贝数改变提示曲妥珠单抗耐药性，因此认为ctDNA中的HER2拷贝数可作为监测曲妥珠单抗治疗进展期胃癌的疗效指标。
免疫检查点抑制剂治疗获得性耐药机制复杂，治疗选择压力下的亚克隆演进仅为部分原因。在当前更活跃的转化研究领域中，ctDNA靶向测序、全外显子和（或）全基因组检测，乃至单细胞组学、宏基因组、空间基因组学等诸多新技术已开始被应用。在阿维鲁单抗（avelumab）联合EGFR单抗、改良FOLFOX6方案治疗微卫星稳定、RAS/BRAF 野生型转移性结肠癌的Ⅱ期临床试验中，基于ctDNA NGS检测发现选择性压力下会继发PD-L1突变亚克隆演化，少数患者可出现导致RNA衰减的PD-L1 K162fs突变以及增强蛋白降解的PD-L1 L88S亚克隆。然而，尽管目前的研究显示基于ctDNA NGS检测在探索耐药分子机制和用药指导中有一定优势，尤其可为疑难或复杂例的临床诊断或治疗方案制定提供重要参考，但是作为一种新兴的技术手段，尚缺乏足够的临床数据支撑其在临床实践中常规应用。相信随着临床有效性和效用性研究的不断深入，ctDNA检测在耐药方面将发挥更大的价值，从而使更多患者获益。
专家共识：在临床环境中，ctDNA NGS检测可用于识别分子靶向治疗的耐药机制，尤其对于疑难复杂的患者，该结果有助于后续的治疗选择决策。免疫检查点抑制剂治疗获得性耐药机制复杂，治疗选择压力下的亚克隆演进仅为其部分原因，ctDNA靶向测序、全外显子和（或）全基因组检测仅作为其转化研究工具之一。
03
ctDNA NGS检测的标准
3.1 ctDNA NGS检测的实验要求
3.1.1 场地要求 应严格遵循二代测序实验的总体设计与要求，强调“各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作”原则，配备满足开展ctDNA NGS测序项目所需的仪器设备。若实验同时开展基因组DNA和ctDNA检测，应设置不同的样本制备区、文库制备区，以避免高浓度组织核酸对低浓度ctDNA的污染。
3. 试剂耗材要求 实验应优先选择获得NMPA三类医疗器械证的检测试剂和配套耗材。若暂时没有，可用经过性能确认的临床实验自建项目（laboratory developed test，LDT）试剂替代。LDT包括以下情况：FDA注册或批准但实验进行了修改的试剂或检测系统；未经FDA注册或批准的试剂或检测系统；未提供性能指标的试剂或检测系统。所有LDT试剂耗材在用于检测前应进行性能确认，并形成试剂制备和使用的标准操作规范（standard operating procedure，SOP），报上级主管部门备案。实验所建立的LDT试剂禁止在本实验以外的实验使用。每批试剂应进行质检，并保存相应记录。
实验体系构建
.1 检测流程与质量控制 ctDNA NGS检测的建立与优化涉及分析前、分析中以及分析后的三个阶段多个步骤，实验质量管理需贯穿ctDNA NGS检测的整个流程。分析前阶段包括样本采集、运输、保存等处理，每个步骤应制定与实验实际操作相符合的SOP，并按照SOP执行。分析中阶段包括“湿实验”和“干实验”两个步骤，“湿实验”包括核酸提取、引物或探针设计合成、文库制备、上机测序等步骤，其中文库制备可选择杂交捕获或扩增子建库，该阶段的质控应对核酸提取中的核酸浓度、纯度和片段分布做出相应要求并遵照执行；“干实验”涵盖生物信息学分析流程各步骤，该阶段质控应对更低测序深度、平均测序深度、覆盖均一性、鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine，GC）含量、碱基识别质量值、比对质量值和在靶率等作出相应要求并遵照执行。分析后阶段包括检测报告解读、分子专家委员会（molecular tumor board，MTB）讨论和遗传等，该阶段应制定结果报告及解读SOP，并遵循准确、及时和充分的原则。此外，实验应根据实际情况，建立内质量控制，间质量评价以及间比对等SOP，并遵照执行。
3. 试剂性能验证或性能确认 实验使用已获批的高通量测序试剂开展临床检测服务前，必须对试剂进行性能验证。如果实验改变已批准试剂指定的预期用途、试剂组分、操作流程，则按照LDT试剂要求进行管理，临床检测前需对检测系统（包含人、机、料、法、环等）的分析性能进行确认。实验应建立试剂性能确认检测操作全过程SOP，明确试剂的分析性能指标和检测局限性。分析性能评价指标至少应包括精密度、准确度、分析敏感性、分析特异性（包括干扰物质）、可报告范围。
3.3 样本收集、处理原则
3.3.1 样本采集和前处理 建议采用含细胞稳定剂的抗凝管，如Streck采血管等游离核酸专用采血管，实验也可根据实际情况选择合适的采血管。根据检测要求采集适量的外周血，一般为10 mL，采血后轻柔颠倒8~10次，使保存液和血液充分混合，避免凝血或溶血发生。血液离体后应尽快送至检测实验。实验应根据实际情况制定保存运输时限及温度要求。建议采用两步离心法分离血浆，步：2~8 ℃，1 600~1 900 g离心10 min，将上清转移至新的离心管中；第二步：2~8 ℃，16 000~20 000 g离心10 min，转移上清至新离心管。分离血浆可直接抽提ctDNA，或保存于-80 ℃至使用时，保存过程中应避免反复冻融。
3. 样本制备与质控 临床上目前常用的cfDNA提取方法有离心柱法和磁珠法，应根据检测要求选择合适的方法。提取的核酸应在2~8 ℃下储存且不超过24 h；若超过24 h，建议在-30 ℃至- ℃下储存，并避免反复冻融。进行文库制备前，建议采用合适的技术方法对获得的cfDNA总量和片段分布进行分析，判断是否满足实验制定的质控要求。若不满足后续检测需求，应采取相应措施处理，必要时重新采集样本。
专家共识： ctDNA NGS检测实验质量管理需贯穿全程，ctDNA收集、样本处理和自动化过程应按照标准化和临床验证程序进行，更大程度防范因操作差异而引发的阴性可能。样本采集建议采用含细胞稳定剂的抗凝管，尽快完成血浆分离，提取的cfDNA建议在24 h内进行后续检测，否则，置于-30 ℃至- ℃下储存并避免反复冻融。
3.4 ctDNA NGS检测技术要点
3.4.1 文库构建策略 采用NGS方法进行ctDNA检测的靶向测序策略主要分为两种：基于杂交捕获的靶向NGS（hybrid capture NGS）和基于扩增子的靶向NGS（amplification-based NGS）。基于杂交捕获的靶向NGS方法是通过捕获探针与基因组中特定区域杂交，从而获得目的区域的序列并进行分析的方法。该方法操作步骤多，过程相对复杂，需要1~2 d完成建库上机，可以检测点突变，小片段的插入缺失和拷贝数变异，以及DNA面的基因重排，且可以发现一些未知融合，检测灵敏度可达95%以上。目标序列捕获法建库使用的探针设计有DNA探针和RNA探针，主要对目标区域进行靶向富集，确保样本目标序列完全富集，提高富集效率和覆盖的均一性，有效降低测序成本。基于扩增子的靶向NGS方法依赖多重PCR扩增步骤富集目标序列。实验过程中，基于扩增的文库制备的实际操作时间通常比杂交捕获方法短。对于基因数目较少，用药相关热点突变明确的panel可以采用靶向扩增子测序，扩增均一性在引物设计时需要优化调试。两种测序策略各有优劣，实验可依据检测的靶向测序panel大小、基因种类、突变类型及时效要求等选择不同测序策略，并依据专利技术进行适当优化，从而提升基因文库的构建质量和效率。不论采用何种方法，每个检测项目都应设定明确的合格文库标准，上机测序前应对文库浓度和文库片段分布进行分析，合格的文库标准应包括片段是否相对集中，有无游离接头，有无接头二聚体，片段大小是否在推荐文库片段范围内等内容。
3.4.2 分子标签策略 对于cfDNA样本的突变检测下限期望达到0.1%甚至更低时，仅靠增加测序深度已不足以提升灵敏度，建库过程PCR结果引入的错误和测序造成的系统误差都会增加阳性结果。使用分子标签技术和优化对应的生物信息分析设置，可以过滤由于测序平台随机误差导致的阳性结果，从而实现更高的灵敏度。其原理是在文库制备过程中，通过添加一段3~8 bp随机序列作为分子标签（unique molecular identifier，UMI），该法可以灵敏地识别PCR重复片段并校正PCR扩增错误，从而进行正确的DNA片段溯源，提供更可靠的突变分析。
3.4.3 参数确定策略 对于大多数实体恶性，血浆中的ctDNA水平较低，突变等位基因分数在晚期转移性疾中通常低于10%，在局部晚期非转移性疾中低于1%。ctDNA水平在癌症早期和治愈性治疗后更低，其突变等位基因频率通常小于0.1%。因此，需要高度灵敏的方法检测血浆ctDNA。国内驱动基因分析联盟（CAGC）建议血浆cfDNA标本的NGS有效测序深度应达到1 000×以上，并应在80%以上的目标区域达到这个深度，而非所有区域的平均，否则在区域间覆盖波动较大的情况下，会有大量区域出现覆盖不够的情况。肺癌微小灶残留定义、检测与应用国内胸部学专家共识中指出：采用NGS靶向测序多基因检测panel进行MRD检测时，基本技术标准是可稳定检出丰度≥0.02％的ctDNA。NCCN指南推荐且应用相对成熟的Signatera扩增子NGS技术的平均测序深度高达100 000×以上。这也提示早期癌症检测和微小灶残留检测需要更高的测序深度。目前检测策略众多，不同策略对测序深度和广度的标准也有待进一步的循证医学证据支持。
3. 测序平台选择 目前使用较多的NGS测序平台是因美纳（Illumina）、安康智造（MGI）和赛默飞（Thermo fisher）平台。尽管技术性能相似，但平台之间DNA投入要求、试剂成本、运行时间和读取长度等均存在差异。Illumina平台高通用性和可扩展性高，可对不同大小靶向测序panel进行灵活分析。同时也需要更高的DNA和RNA投入，测序时间长，测序成本高，需要更全面的生物信息学支持。MGI平台在有高通用性和可扩展性的同时，还具有测序重复率低、有效数据利用率高、测序速度快、测序成本相对较低等优势，尤其适合用于需要高数据量的ctDNA检测。Thermo fisher平台通量小、测序时间短、测序成本低，同时配备内置生物信息学分析流程，便于数据自动化分析。，三大测序平台各有优劣，不同实验可以依据样本量、测序数据量以及时效要求等选择相应的测序平台。
3.5 生信方法要求
3.5.1 基于分子标签技术的数据质控和数据分析 ctDNA检测常出现PCR重复序列比例高（50%~90%）、PCR扩增和测序错误等引入的背景噪音高等问题。同时，血液中白细胞的克隆性造血突变也影响ctDNA变异的鉴定。基于分子标签技术的分析流程可帮助有效去除背景噪音，配对白细胞样本或背景库的建立可有效去除来自白细胞中克隆性造血突变引入的阳性，提升ctDNA检测的准确性。UMI通过给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建和PCR扩增后一同测序，根据不同的标签序列可以区分不同来源的DNA模板，分辨源于PCR扩增及测序过程中随机错误产生的阳性突变，识别cfDNA中真正来源于的突变，从而提高检测灵敏度和特异性，可达0.1%的检出限。一般推荐1条UMI对应并至少3条reads。
3.5.2 测序噪音控制 建立背景库过滤噪声的大致思是通过使用相同测序流程的样本估计基因组坐标对应区域或碱基的测序错误率，然后使用设检验等统计方法比较目标样本对应坐标的突变频率是否显著高于估计得出的测序错误率。通过对患者样本建立背景库过滤噪声的常用方法有SiNVICT和OutLyzer。SiNVICT使用样本计算出一段基因组区域的噪音水平，通过计算信噪比的方法过滤潜在的阳性结果。OutLyzer通过计算目标突变附近200 bp内的每个坐标的测序错误率，并通过多次Thompson’s Tau Test过滤离群噪声。在可用样本较为充足的情况下，使用多个患者的正常样本建立背景库能较准确地估计噪声水平。其中代表方法有Mutect1/Mutect2（GATK），该法使用不少于40个没有细胞污染的正常样本构建背景库。在此基础上发展的基于不同算法的构建背景库算法，如基于二项分布的TNER、基于高斯分布模拟的IDES、基于泊松分布的AmpliSolve等，均可有效提升突变检出准确率和召回率，去除背景噪音。
3.5.4 数据的储存与管理 随着测序深度的增加，ctDNA下机数据有效安全的储存需要配备相应的基础设施。高通量测序会生成大量文件，下机的fastq或bam原始文件、vcf结果文件等需长期保存，同时应保存好测序过程中完整的日志文件，以便区分高通量测序分析软件版本信息、追溯异常结果。诊断实验应保存相关数据至少3年，并在相关技术人员的支持下制定数据备份计划和恢复计划。
专家共识： ctDNA NGS检测应根据项目需求选择技术线，可依据检测基因数量及覆盖范围大小选择不同测序策略。在进行基于ctDNA的超高灵敏度突变检测时，建议使用分子标签技术和优化对应的生物信息分析设置，以降低由于测序平台随机误差导致的阳性结果；建议通过建立测序噪音和克隆性造血背景库的方法降低克隆性造血及背景噪音带来的影响。
3.6 报告要求
3.6.1 专注团队建设 实验负责人应具有临床医学专注背景、分子生物学相关工作经历、副高级以上专注技术职称。主要报告签发人员应具备临床医学、分子生物学和遗传学等多种专注背景，了解的临床治疗指南以及临床试验更新进展，更好具有2 年及以上组织多基因NGS检测分析工作经历。报告如涉及基因胚系变异分类与临床意义阐释，建议结合临床遗传同步开展。旨在进行ctDNA NGS检测全面分析与复杂临床场景应用的机构，鼓励建立由多学科专家组成的MTB。
3.6.2 报告内容 ctDNA NGS检测的临床报告应包含以下内容：
⑴受检者的基本信息。应明确包含受检者姓名、、出生日期或年龄、接受检测的日期、检测的目的（需要明确疾发状态或携带者状态）和受检者的临床指征（应至少包含疾的诊断或初步诊断）等。
⑵样本信息。每份样本应有唯一标识，注明样本类型、采集时间、采集部位、送检时间、检测报告时间和样本主要质控情况（如DNA质量评估以及测序质量评估等）。
⑶实验信息。包括实验名称、实验操作人员、报告审核人员、联系方式。
⑷检测项目。包括基因panel的检测位点及检测范围、检测仪器、检测试剂，是否为NMPA批准使用的检测试剂以及NMPA获批的基因位点信息，或LDT试剂、检测方法、检测下限等。
⑸检测结果及变异解读。对基因变异的检测结果进行解读，如检出的基因型、变异结果、染色体变化情况、检测结果的致性分级、药物信息及临床意义、变异解读引用的参考文献等；对于多次检测的患者，报告需要体现既往检测结果，并综合解读本次检测结果。
⑹标注检测方法的实验内部验证结果，检测局限性及不确定性，以及进一步检测的建议。
3.6.3 变异结果的命名规则 对基因变异的描述应遵循一定的原则和规范，推荐参考人类基因组变异协会命名指南（。hgvs。org，登录日期2022年6月22日），转录本的选择建议采用基因座参考基因组序列数据库（Locus reference genomic；。lrg-sequence。org，登录日期2022年6月22日） 界定的转录本或多个数据库公认的主要转录本。对遗传性相关基因变异的说明，建议以美学遗传学学院（American college of medical genetics and genomics） 指南为标准，在检测结果中列出具体的变异位点信息，包括基因名称、所参考的人类基因组版本、转录本参考序列版本、核苷酸变异、氨基酸变异、外显子/内含子序、等位基因杂合性、染色体编及坐标等。
3.6.4 指导用药的循证分级规范 对于体细胞突变的临床意义解读，建议依据伴随诊断、临床指南、数据库或文献证据进行分级，可以将体细胞基因突变分为临床意义明确（Ⅰ级）、有潜在临床意义（Ⅱ级）、临床意义不明确（Ⅲ级） 和良性或可能良性突变（Ⅳ级）。实验应建立突变临床意义分类及分级和报告的SOP，且SOP应至少包括以下两个方面：⑴对体细胞基因突变进行分级的流程; ⑵明确报告中应包含哪一级或哪几级突变位点。分级的流程应有记录，包括证据来源的指南、文献、数据库、证据等级、分级结果等。临床证据决定突变位点分级，可参考AMP、ASCO、CAP联合发布的样本测序突变解读共识。
对胚系突变的临床意义解读，可参考中外诊疗指南及重要参考文献，Online mendelian inheritance in man （https：//omim。org，登录日期2022年6月22日）和美国ACMG指南等资源。目前，对于胚系突变分级主要参考ACMG指南，其将变异位点致性等级分为致、疑似致、临床意义未明、疑似良性和良性等5个等级。报告中应列出与遗传性（如遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征、Lynch综合征等） 相关的致以及疑似致变异，并对变异的致性进行分析解读。对于意义不明位点的处理，实验需制定相关政策，确定是否报告临床意义不明的位点，并附上说明和参考数据库，并且要在报告中注明本实验出具临床报告的规则。
3.6.5 其他检测方法的结果验证 对血液样本进行高通量测序检测时如出现较低丰度的突变结果（通常血液样本低于检测下限） 时，建议综合评估高通量测序实验平台性能、测序深度以及细胞比例等因素。特别对于靶向治疗相关的基因，建议使用其他检测方法进一步验证确认，如数字PCR等方法。
3.6.6 检测局限性 外周血中ctDNA含量不足，由于受检者携带的突变可能没有包含在检测基因谱中等原因，检测可能存在阴性结果。如果血浆检测结果为阴性，必要时仍需采用其他类型样本进行验证。另外，由于大多数基于ctDNA NGS未配对检测白细胞，如果存在胚系变异或由克隆性造血引起的体细胞突变，也可能导致阳性结果，因此在结果报告中应对ctDNA的检测基因范围、检测方法和检测下限等重要性能指标进行说明。当通过ctDNA NGS检测进行靶向用药指导或遗传性风险评估时，其评估标准应综合考虑驱动分子事件、临床治疗因素以及分析筛选策略。ctDNA NGS临床检测报告的解读对患者预后、复发监测、用药指导具有重要的参考价值。因此，报告应该明确、简洁、准确，并具有充分的解读、可信性和权威性。
专家共识：ctDNA NGS临床检测报告应包含受检者基本信息、样本信息、实验信息、检测项目、检测结果及变异解读、检测方法的实验内部验证结果、检测局限性及不确定性以及进一步检测的建议等内容。实验应建立报告SOP，建议根据国内外文献、共识指南、临床试验证据和实践对检出的基因突变进行分类或分级报告。
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ctDNA NGS检测临床应用展望
目前已有部分基于基因变异信息的复合预测生物标志物用于预测免疫检查点抑制剂和分子靶向治疗疗效，从而对患者进行分，如微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和突变负荷（tumor mutation burden，TMB）。临床研究表明基于ctDNA NGS检测的bMSI（blood MSI）和bTMB（blood TMB）具有免疫检查点抑制剂疗效预测价值。FDA于2020年8月26日批准基于ctDNA NGS数据拟合bMSI和bTMB的试剂盒用于泛实体瘤多个靶向药物及免疫检查点抑制剂的伴随诊断。但bMSI和bTMB在临床应用中受多种因素影响，如样本采集时间、检测panel基因覆盖范围、panel大小、测序深度、生信算法及阈值设定等，因此还需要更多的前瞻性临床研究证据支持ctDNA NGS数据拟合的bMSI和bTMB的临床应用前景。
同源重组修复缺陷（homologous rebination deficiency，HRD） 检测在聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂和铂类药物敏感性预测及易感性评估中具有重要的临床应用价值。HRD状态可通过同源重组相关基因突变（homologous rebination repair，HRR）检测和基因瘢痕（genomic scar，GS）检测两种方式判断。目前仅有两种组织检测试剂Myriad MyChoice CDx以及Foundation FocusTM CDx BRCA LOH获得FDA批准用于伴随诊断及补充诊断。两者均采用HRR联合GS检测策略评估HRD状态。由于基于ctDNA NGS对GS进行评估技术上具有巨大挑战，所以目前基于ctDNA NGS检测进行HRD评估主要集中在HRR信通基因SNP检测，但国内外对HRR基因的定义尚缺乏统一标准；另外，随着检测技术的进步，基于ctDNA NGS评估GS逐渐成为可能，但目前基于ctDNA NGS检测评估HRD尚有巨大的探索空间。
ctDNA中包含核酸序列、位点突变、拷贝数、甲基化、MSI、序列长度、序列丰度、出现的时空模式、在基因组上的位置特征、起始位点和终止位点特征等丰富的生物信息，如cfDNA片段的长度分布、核小体位置与正常细胞显著不同，这些信息可应用于筛查和诊断中。为了更好地整合多源异质信息，更全面描绘生物特征，大幅提高ctDNA数据的效力，机器学习、深度学习等人工智能算法也被大量应用到的筛查和诊断中。CancerSEEK的癌症早筛项目通过监测ctDNA中16个基因的突变及血清8个蛋白质生物标志物水平，并构建 Logistic回归模型，结果该模型在8种共包含1 005例患者中的敏感性为69%~98%，特异性为 99%。更新的应用机器学习分类器辅助的深度甲基化测序能检测到52%~81% 临床分期为ⅠA~Ⅲ期的患者，且检测限低至万分之一，显示了更高的敏感性和特异性（特异性为96%，95%CI：93%~98%）。
，基于ctDNA NGS检测的bTMB具有免疫检查点抑制剂疗效预测价值，但仍有诸多因素影响bTMB检测在临床中的应用，未来还需开展更多的前瞻性临床研究。机器学习等人工智能算法不仅能降低阳性、提高灵敏度，还能有效整合多维度的异质信息进行全面分析，大幅提高ctDNA数据效力，是ctDNA数据分析的主要方向。
利益冲突：本共识由专家组内部成员针对性讨论得出，专家组编写过程中未接受生物医药公司任何形式的赞助，所有专家组成员均不存在利益冲突。
专家组：略 / 参考文献 略
不感兴趣
看过了
检测,ctDNA,,突变,测序
二、抽血验dna准确率高吗
亲情是亲人对自己的关爱，像春天里的阳光，自古以来，人们形容亲情一般都是“血浓于水”四个字，象征着亲人的血脉是可以融在一起的，古时候便有滴血认亲的说法，现在社会也会通过血液中的DNA来进行亲子鉴定。现在科学技术那么发达，抽血检测DNA不仅可以亲子鉴定，还可以鉴定胎儿，这才是科学看方法。
检测DNA可以鉴定胎儿
DNA怎么看还孩
DNA是通过基因工程的技术，可以用来鉴别胎儿，主需要采取母体静脉的血液，再利用多种技术离心分离dna染色体，检测血液样品中是否存在Y染色体，从而确定胎儿。
做DNA检查需要抽血
因为主要由男方的性染色体决定，因为卵子所含性染色体只有X一种，而精子可分别含X或Y性染色体。如果含Y染色体的精子与卵子结合，受精卵为XY型，发育成男胎；受精卵为XX型，发育为女胎。因此，DNA测的原理如下：一种被称为“SRY”的基因只存在于Y染色体上，一旦检测到它的存在，便意味着胎儿性，因此从分离出母亲血液中的胎儿DNA是否检测出SRY基因，疑问自然迎刃而解。大家要知道，平时孕妇做的产检项目无创DNA也是可以鉴别胎儿，DNA是非常安全的一种检查方法，这种抽血检查的方式对胎儿及母体没有任何风险。不仅如此，通过DNA检测还可以了解胎儿健康状况，排除一些存在遗传的致基因，从而达到优生优育。
DNA鉴别准确率高不高
DNA血液鉴定这项技术在国内已经非常成熟，一般来说孕妇怀孕满8周之后做，据说检验可靠性大约达98%，B超要等到胎儿足够大时才能观察特征不同来判断，但DNA这种检查手段在受孕后8周便可执行，而且准确率比B超高。
DNA具有准确率高的优势
总的来说，DNA具有：对孕妇胎儿无影响、鉴定结果快、鉴定准确率高等优势，在医疗上来说算是比较可靠实用安全的方法。虽然说通过抽血检测DNA可以很准确的验出宝宝的，但是我国是不允许随意检测胎儿的，若就有相关医学指征可以。
相关疑问释疑
要满足什么条件才能做DNA测？
我国规定不允许随意检测胎儿，除了符合一定的医学指征，比如说与胎儿有关的遗传，男性发，而女性却不发，这就是X连锁隐性遗传，需做胎儿。如血友、蚕豆、先天性丙种球蛋白血症等。
DNA检测胎儿要需要多少钱？
怀孕dna检测一般正常花费在2800-3500元左右，依据各地的收费标准无创DNA价格从1000元到3500元不等。具体费用由于地差异以及等级而不同，详细请到当地。
抽血做DNA检测几天出结果？
DNA具有鉴定结果快、准确率高等优势，但是DNA出报告的时间每个都是不一样的，大部分不排队的话1-3天可出结果，但是有的DNA鉴定要一个星期左右才能拿到报告单。
怀孕多久可以做dna测？
怀孕12周以内做dna可以测出胎儿，一般普通的DNA检查也可以在怀孕8周以后进行检测。需要注意的是孕妇孕期是不允许做胎儿的，这是违法的行为。
民间热门看方法大全
自古以来，不少人都在探索的奥妙，时代在更新的同时预测胎儿的方法也在不断更新，于是网上出现了胎心率看、肚形判断、试杯测等不少预测胎儿的方法，这也意味着话题的热度还是很高。为了方便有需求的朋友查阅，这里整理了55种民间热门看方法。是自然选择的结果，取决于受精卵中的一对性染色体，通过以上55种方法并非可以准确的测出胎儿，目前选择更准确的方法就是做三代试管，但国内不允许进行非医学必要的选择，据网上了解，目前合法选择的国家有美国、俄罗斯等。
三、dna抽血检查的是什么
dna是怎么检测出来的大部分是没有做DNA亲子鉴定的，但是当地的亲子鉴定中心可以做获取当地中心电话
一、dna是怎么检测出来的
脑动脉血管瘤能活多久
脑动脉血管瘤的因有很多种，对人的伤害也是非常大的，随着医疗技术的发展，这种疾的治疗方法也有了新的突破，治愈也不是很困难的，所以，早期的发现与治疗是至关重要的，同时也需要注意术后的护理工作。
带状疱疹疼痛和带状疱疹后神经痛
带状疱疹是由水痘毒引起的皮肤科疾，以沿神经走行的束带状疼痛和皮肤疱疹为特征。此毒与引起小儿水痘的毒相同，与神经细胞有较强的亲和力，当儿童时代的水痘治愈后，此毒长期潜伏在脊髓后根神经节、半月神经节、膝状神经节等神经细胞内，当宿主机体免疫力降低时再度活跃，引起带状疱疹。
外阴营养不良吃什么药
很多女性被外阴营养不良纠缠，十分痛苦，该疾的发原因复杂，对患者造成的伤害和影响不容小觑，对于任何疾，都是有一定的发原因的，我们只有找准因，才能从根本上治疗和预防，外阴营养不良包括萎缩型营养障碍和增生型营养障碍，不同的类型，所用药物也不一样。
宝宝起湿疹怎么办
湿疹不仅很难根治，而且还容易反复发作，这还真是困扰了不少妈妈和宝宝们。尤其是对于婴幼儿时期宝宝娇嫩的皮肤，很多药物都不敢随意的乱用，怕影响孩子的皮肤健康，所以更好在的指导下用药比较安全。
湿疹用什么药膏更好
湿疹是我们日常生活中一种常见的疾，经常发生于人体的表面，湿疹看似是简单的皮肤疾，却严重危害着人们的心理和生理。这种以复杂的因而让人们熟知而害怕。对于湿疹的发生，大家一定要做好预防，防止他对身体的危害，引起湿疹的原因有很多，得了湿疹除了日常生活调理之外，还可以怎样做呢？让我们一起来看看吧。
二、dna是怎么检测出来的原理
DNA检测可以通过多种技术进行，包括PCR、DNA芯片、测序等。详情如下：
一、测序：测序技术可以将DNA序列信息获取出来，特别适用于未知基因或基因组的研究。常见的测序方法包括Sanger测序和下一代测序（NGS）。具体操作包括以下几个步骤：
1、DNA片段制备：将待测DNA进行片段化处理。
2、清洁和纯化：对DNA片段进行清洁和纯化，去除杂质。
3、测序反应：将片段化的DNA与引物进行反应，通过添加适当的酶和核苷酸，使得DNA逐渐合成新链，并产生荧光信。
4、信读取和序列分析：通过测序仪器读取荧光信，并将其转化为DNA序列信息。随后，对得到的序列信息进行比对和分析，以获得准确的DNA序列。
二、PCR：PCR（聚合酶链式反应）是将少量DNA扩增为大量的技术，可以用于检测某些基因突变、DNA损伤等。具体操作包括以下几个步骤：
1、提取DNA：从样本中提取出待检测的DNA。
2、设计引物：根据目标基因的序列设计引物，引物是一对短链DNA片段，用于定位和扩增目标基因。
3、进行PCR扩增：将待检测的DNA与引物一起加入PCR反应体系中，通过多次循环的温度变化，使得目标DNA片段被扩增成大量可检测的DNA产物。
4、检测PCR产物：通过电泳等方法，将PCR产物进行分析和检测，从而确定目标基因是否存在突变或损伤。
三、DNA芯片：DNA芯片是一种高通量的基因检测技术。它基于DNA探针和待检测样本之间的互补配对原理，通过比较样本和探针上的DNA序列匹配程度来检测样本的基因型。具体操作包括以下几个步骤：
1、制备DNA芯片：在玻璃或硅片上连接数万到数百万个DNA探针。
2、样本处理：将待检测的DNA样本进行预处理，如放大、标记等。
3、杂交反应：将样本与DNA芯片上的探针进行杂交反应，形成特异的DNA双链结构。
4、检测信：通过读取芯片上的荧光信或其他信，分析和比较样本与探针之间的匹配程度，从而确定样本的基因型。
除了以上方法，还可以通过血液检查进行DNA检测。血液样本中含有白细胞，其中包括核细胞，这些细胞中含有DNA。通过提取白细胞，然后进行相应的PCR、芯片或测序技术
三、做一份dna鉴定要多少钱
DNA检查主要是通过抽血检查，能够判断体内是否有异常的情况。
DNA检查是一种分子遗传学的检测方法，主要是通过抽血进行检查，能够判断体内是否有染色体异常的情况，比如染色体数目异常或染色体结构异常，也可以判断是否患有遗传性疾。
如果在检查的时候发现体内有异常的情况，需要及时进行进一步的检查，比如羊水穿刺检查、染色体检查等，从而判断是否有染色体异常的情况，并采取合适的治疗措施。
在怀孕期间要注意保持良好的生活习惯，避免接触有毒有害物质，还要注意保持营养均衡，能够促进胎儿的健康发育，并且还要定期到做，从而判断胎儿是否有异常的情况。
四、dna是怎样检测的
情分析:DNA即脱氧核糖核酸，脱氧核糖核酸可通过获取检测者的血液、皮肤等组织检测。此外，孕妇还可以通过羊水穿刺，对胎儿进行脱氧核糖。如果孕妇想在孕期检测胎儿的脱氧核糖核酸，可以通过羊水穿刺抽取羊水，再采取专注设备对羊水中的脱氧核糖核酸进行分析。建议大家可以到正规进行脱氧核糖，不宜到不正规的进行检测，这样可以增加脱氧核糖结果的准确性。
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四、抽血查dna是干什么的
[微风]白细胞高，别慌！看我如何助你恢复健康[微风]
昨天快下班的时候，我接诊了一位患者，她手紧握着检查报告，显得有些紧张和焦虑。她更近说总是感觉身体乏力，容易疲劳，还有点低热。我接过李阿姨的检查报告，发现她的白细胞计数明显高于正常值。白细胞是人体免疫系统的重要组成部分，其升高通常意味着身体正在与某种疾作斗争。[棒棒糖]
为了进一步了解原因，我建议李阿姨进行更详细的检查，包括血液涂片、炎症指标等。结果显示，她的中性粒细胞比例也偏高，这通常与感染或炎症有关。经过综合评估，我告诉小玲：“你的白细胞高可能是由于细菌感染引起的，不必太过担心。我们会根据你的具体情况制定治疗方案。”我为她开了一些抗生素药物，并叮嘱她注意休息和饮食。还提醒她注意个人卫生，避免再次感染。[锦鲤]
药物治疗是我们治疗的步。我为她选择了阿莫西林帮助她缓解症状，当然，每次复诊，我都会仔细询问她的症状变化，根据反馈调整药物和剂量。
定期复查则是我们监控情的重要手段。我叮嘱她要按时复查，不要掉以轻心。
患者非常配合治疗，按时服药并注意休息。一段时间后，她的症状逐渐缓解，白细胞数值也慢慢恢复正常。看着她从痛中走出来，我深感欣慰。在这里，我也想提醒大家，白细胞高并不一定是重，但也不能掉以轻心。在治疗期间，需要注意以下几点：遵医嘱服药：按时按量服用开具的药物，不要随意更改剂量或停药。注意休息：保持良好的作息习惯，避免过度劳累。饮食调理：多摄入富含维生素和矿物质的食物，增强身体免疫力。定期复查：遵医嘱定期复查血常规等相关检查，以便及时了解情变化。[锦鲤]
江东向
副
中医内科
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